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投稿时间：2023-12-19
投稿时间：2023-12-19
中文摘要: 为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶（Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase，BloSPase）合成2-Oα-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸（2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid，AA-2G）的潜力，该研究将BloSPase 基因在大肠杆菌中异源表达，以BloSPase 的水解酶活力为指标，通过单因素试验和响应面法对其表达条件进行优化；并通过镍柱纯化后对其转糖基化活力进行研究。结果表明，BloSPase 的最佳表达条件为诱导时间10 h、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）浓度0.47 mmol/L、诱导温度23 ℃。在该条件下，水解酶活力可达到（730.35±0.58）U/mL，比酶活达到（95.22±2.45）U/mg。酶学性质研究显示，BloSPase 转糖基化活力的最适反应温度为50 ℃，最适反应pH 值为5.2，在40、50 ℃时表现出较强的热稳定性。其动力学参数Km 值为（266.80±23.76）mmol/L，Vmax 值为（0.235 0±0.009 9）mmol/（L·min）。
Abstract:To explore the potential of Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase（BloSPase）to synthesize 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid（AA-2G），BloSPase gene was heterogeneously expression in Escherichia coli in this study. Using the hydrolytic enzyme activity of BloSPase as the indicator，the expression conditions were optimized by single-factor experiments and response surface method. The activity of transglycosylation was studied after purification by nickel column. The optimal expression conditions of BloSPase were as follows：induction time of 10 h，final concentration of isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）of 0.47 mmol/L，induction temperature of 23 ℃. Under these conditions，the hydrolytic enzyme activity and specific activity of BloSPase reached（730.35±0.58）U/mL and（95.22±2.45）U/mg，respectively. Enzymatic property studies showed that the optimum reaction temperature and optimal reaction pH value of BloSPase transglycosylation activity were 50 ℃and pH5.2 respectively，and the enzyme showed strong thermal stability at 40 ℃and 50 ℃.The kinetic parameters Km and Vmax were（266.80±23.76）mmol/L and（0.235 0±0.009 9）mmol/（L·min）respectively.
keywords: sucrose phosphorylase Escherichia coli heterologous expression transglycosylation activity enzymatic properties
文章编号：202405027 中图分类号： 文献标志码：
基金项目:国家重点研发计划课题（2022YFF1100801）；2022 年天津市研究生科研创新项目（服务产业专项）（2022SKYZ081）；天津市科技计划项目（20YFZCSN00630）；天津市大学生创新创业训练计划项目（202310069097）
| 作者 | 单位 |
| 项蓉1，杨金山1，娄婷婷2，3，吴子健1，张宏宇1 *，赵彦巧1，王丹芸1，张得光1，马兴3 | 1.天津商业大学 生物技术与食品科学学院 天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；2.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；3.天津海关动植物与食品检测中心，天津 300461 |
引用文本：
津ICP备20000603号-1