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投稿时间：2022-12-06
投稿时间：2022-12-06
中文摘要: 为提高牛奶中大肠杆菌的检测效率，简化分析流程，该文建立基于成簇的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）的牛奶中大肠杆菌快速检测体系。首先，构建CRISPR 相关蛋白（CRISPR-associated protein，CRISPR-Cas），CRISPR-Cas12a 的重组表达质粒，并将其转化至BL21 感受态细胞，利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（lsopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达Cas12a 蛋白。然后，通过麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）亲和层析、凝胶过滤层析等方法将Cas12a 蛋白进行纯化。最后，设计靶向大肠杆菌16S rDNA 目的片段的特异性CRISPR RNA（crRNA），将特异性的crRNA、大肠杆菌16S rDNA 的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）胶纯化产物和纯化的Cas12a 蛋白进行混合，建立CRISPR-Cas12a 靶向切割体系。验证结果显示该体系可用于检测牛奶样品中的大肠杆菌。
中文关键词: CRISPR-Cas12a 牛奶 大肠杆菌 细菌检测 16S rDNA
Abstract:In order to improve the detection efficiency of Escherichia coli（E. coli）in milk and simplify the analysis process，a rapid detection system of E. coli in milk based on clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）was established. First of all，the recombinant expression plasmid of CRISPR-Cas12a was constructed and transformed into BL21 competent cells，and Cas12a protein was induced by isopropyl β-Dthiogalactoside（IPTG）. Secondly，Cas12a protein was purified by maltose binding protein（MBP）affinity chromatography and gel filtration chromatography. Finally，specific CRISPR RNA（crRNA）targeting the target fragment of E. coli 16S rDNA was designed，and the specific CRISPR RNA（crRNA）was mixed with the polymerase chain reaction（PCR）products of E. coli 16S rDNA in milk and purified Cas12a protein，so as to establish CRISPRCas12a targeted cleavage system. The verification results showed that the system could be used to detect E. coli in milk samples.
文章编号：202318024 中图分类号： 文献标志码：
基金项目:广东省基础与应用基础研究基金自然科学基金面上项目（2022A1515012602）；广东省教育厅普通高校青年创新人才项目（2019KQNCX150）；惠州学院教学质量工程建设项目（X-ZLGC2021009）；国家大学生创新训练项目（S202210577039）；广东省普通高校特色创新项目（2020KTSCX313）
引用文本：
津ICP备20000603号-1